1950’lerin sonu 1960’ların başında moleküler biyologlar organizma ve hücrelerdeki moleküler birleşiklerin yalıtılmasını, betimlenmesini ve işlemlenmesini öğrendiler. Bu birleşikler canlının genetik bilgisinin kaynağı DNA ve çeşitli enzimlerin, proteinlerin yapısal ve fonksiyonel özelliğinde önemli rol oynayan DNA’ya çok benzeyen hatta bazı çeşitleri DNA tek ipliğinden sentezlenen RNA’lardır. Aşağıda ise moleküler biyologların laboratuvar ortamlarında bu moleküller üzerindeki işlemleri yürütmek için sıkça kullandıkları tekniklerden bahsedeceğiz.

Expression Cloning (Klon protein sentezi tekniği):

Moleküler biyolojide proteinlerin fonksiyonlarının çalışılmasındaki en temel tekniklerden biridir. Bu teknikte ilgilenilen proteini kodlayan DNA’daki gen bölgesi PCR ile çoğaltılarak sentezleme vektörü olarak da bilinen plazmidlere kesici enzimler yardımıyla bütünleştirilir. Plazmidler yapısında promotor denilen tetikleyici bölgelerin etkisi ile istenilen proteinin sentezlenmesini sağlar. Arzu edilen protein dışındaki proteinlerin sentezlenmemesi için ise yine plazmitlerin yapısında bulunan antibiyotik direnç bölgeleri görev yapar.

Özel gen bölgesi eklenmiş plazmitler bakteri veya hayvan hücrelerine enjekte edilir. Plazmidler bakteri DNA’sı ile üç yöntem ile bütünleşir: Bunlar plazmidlerin direk olarak bakteri DNA’sı ile bütünleşmesi olan “Transformasyon”, hücreler arası etkileşimle bütünleşme olan “konjügasyon” ve virüsleri kullanarak plazmidin bakteri DNA’sı ile bütünleşmesini sağlayan “Transdüksiyon”dur. Plazmidleri, hayvanlar gibi ökoryatik canlıların DNA’ları bütünleştirmeye ise “Tranfeksiyon” denilmektedir. “Kalsiyum fosfat transfeksiyonu”, “elektroporasyon”, “mikroenjeksiyon” ve “lipozom tranfeksiyonu” olmak üzere çok farklı transfeksiyon yöntemleri mevcuttur. Plazmitleri ökoryatik canlıların DNA’sı ile bütünleştirmek için bakteri ve virüslerde kullanılabilinmektedir. “Agrobacterium tumefaciens” olarak bilinen bakterilerin kullanıldığı bu işleme “Baktofeksiyon” denilmektedir. Bu plazmidler enjekte edildiği organizmanın genomu ile birleşirlerse oturmuş transfeksiyon, birleşmezlerse geçici transfeksiyon olarak adlandırılırlar.

Bu işlemler sonucunda ilgilenilen protein kodu taşıyan plazmidler enjekte edildiği organizmanın DNA’sı ile bütünleşir ve protein sentezi sürecinde kendi proteinlerini de sentezler. Plazmidlerde bulunan promotor (tetikleyici) bölgeler sayesinde etrafa kimyasallar sinyaller yayılır ve plazmidlerin proteinleri daha yüksek seviyede sentezlenmiş olunur. Yeteri miktar ilgilenilen protein sentezlendikten sonra bunlar bakteri veya hayvan hücrelerinden yalıtılır. Sonrasında elde edilen bu proteinleri fonksiyonel özellikleri, ilaç sanayisindeki etkileri yanı sıra yeni ilaçların proteine verebileceği muhtemel zararları da gözlemlenmiş olunur.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR):

Polimeraz zincir reaksiyonu DNA’nın kopyalanması ve çoğaltılması için kullanılan son derece etkili ve yaygın bir tekniktir. Özetle PCR ile tek DNA dizisi milyonlarca kez çoğaltılabilindiği gibi DNA üzerindeki bir bölgenin veya mutasyona uğramış bir genin belirlenmesinde de yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. PCR ayrıca herhangi bir DNA parçasının cDNA kütüphanesinde olup olmadığı belirlemekte de kullanılmaktadır. PCR’ın birçok çeşidi mevcuttur. Örneğin, RNA’nın çoğaltılmasını ters yazılım gerçekleştirerek sağlayan RT-PCR, DNA ve RNA moleküllerinin sayısına aynı anda ulaşmanızı sağlayan real-time PCR (QPCR) bazılarıdır.

Jel Elektroforezi:

Jel elektroforezi moleküler biyolojinin temel ve başlıca tekniğidir. Temel olarak DNA, RNA veya Proteinleri bir elektrik alan içerisinde ayrıştırılmasıdır. Agoroz jel elektroforezinde DNA veya RNA’lar boyutlarının farklılığına göre elektrik alan içerisinde ayrılırlar. Daha büyük boyuttaki DNA veya RNA parçaları işlem sonunda jelde geride kalırken küçük boyutlu parçacıklar ise başlangıç noktasına göre daha fazla yer değiştirmiş olacaklardır. Proteinler ise elektrik şarjlarına göre “SDS-PAGE” jel denilen sistem üzerinde büyüklüklerine göre ayrıştırılırlar. Bu işlem 2D elektroforezi olarak da bilinmektedir.

Macromolecule Blotting and Probing (Makromolekül Eleme ve Sondalama):

“Northen”, “Western” ve “Eastern” blotlama terimleri aslında Edwin Southern’in elenmiş DNA’daki hibirdazyonları tespit etmek için bulduğu “Southern Blotting” den türetilmiş bir moleküler biyoloji esprisidir. Patricia Thomas, “Northen Blotting” olarak adlandırılan RNA blotlama sistemlerini geliştirirken aslında hiçbir zaman Northen Blotting ismini de kullanmamıştır. Tüm bu terimlerden daha sonra farklı tekniklerde geliştirilmiştir. Örneğin, protein-DNA hibridizasyonunu inceleyen “Southwestern”, protein- RNA etkileşimini inceleyen “northwesterns” ve protein- protein etkileşimini inceleyen “farwesterns”. Tüm bu tekniklere ve terimlere moleküler biyoloji literatürlerinde karşılaşabilirsiniz.

Southern Blotting (Southern Blot):

Edwin Southern tarafından geliştirilen bu teknik DNA’daki özel gen bölgelerin direk olarak incelenmesinde kullanılmaktadır. Restriksiyon enzimleri ile müdahele edilmiş DNA parçacıkları jel elektroforezler ile ayrıştırıldıktan sonra kılcal hareketlerin gerçekleştirileceği özel blotlama yüzeylerine transfer edilirler. Sonrasında bu parçacıkların işaretlenmiş tamamlayıcı DNA parçacıkları ile bütünleştirilmesi sağlanır. Tamamlayıcı DNA parçacıkları genel olarak radyoaktif ışıma yapılanlardan seçilir ama son zamanlarda radyoaktif olmayan parçacıklarda kullanılabilinmektedir. Sonuçta bu ışımalar gözlemlenerek özel gen bölgeleri hakkında bilgiler toplanılır. Fakat PCR tekniklerindeki hızlı gelişmeler sayesinde Southern Blot tekniği laboratuarda çok sık kullanılmamakla beraber yinede gen nakavt ve embriyonik kök hücre hatlarının incelenmelerinde kullanılmaktadır.

Northen Blotting (Northen Blot):

Northen Blot farklı RNA örneklerindeki özellikli RNA ekspresyonu desenlerinin çalışılmasında kullanılmaktadır. RNA denatürasyonun sağlandığı jel elektoroforez tekniği ile bağlantılı çalışmaktadır.  Diğer blotlama sistemlerinde olduğu gibi jel elektroforez ile boyutsal ayrışımı tamamlanmış RNA’ların özel bir blotlama yüzeyine transfer edilir ve gözlenmek istenilen RNA dizisi bu yüzeyde işaretlenir. Farklı işaretleme sistemleri mevcut olmak ile beraber genel olarak işaretlemeler RNA dizilerinin büyüklüklerini göstermektedir. Blotlama yüzeyinde belli bölgelerdeki yoğun yapı ilgilenen RNA dizisinin örnekte hangi yoğunlukta olduğunu gösterir. İlgilenilen RNA dizisinin bulunduğu bandın koyuluğu örneğinizden ne yoğunlukla o bölgenin ifade edildiğini de gösterir. Bu işlem genel olarak farklı RNA örneklerin ne miktarda ortamda ifade edildiğine bakılarak gen ekspresyonları hakkında bilgi elde edilebilinmesi için kullanılır. Canlı organizmalarda hangi koşullarda ve zamanda gen ekspresyonlarının olduğunu belirlemek için kullanılan temel tekniklerden biridir.

Western Blotting (Western Blot):

Antikorlar çok az miktarda proteinin fare, tavşan, koyun (polyklonal antikorlar) veya hücre kültürlerine (monoklonal antikorlar) enjekte edilmesi sonucu hücreler tarafından üretilen biyolojik moleküllerdir. Antikorlar moleküler biyolojide birçok teknik ve analizde etkili bir şekilde kullanılmaktadır.

Western Blotta, proteinler öncelikli olarak SDS (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) jelinde büyüklüklerine göre ayrılırlar. Bu proteinler daha sonra PVDF, nitrocellulose, naylon veya diğer destekleyici yüzeylere transfer edilir ve antikor propları ile bu yüzeyler yıkanır. Antikorlar ilgilenilen proteinler ile bağlantı kurar. Bu bağlantıyı gözlemlemek için renk üretici olarak kullanılan “chemiluminescence” veya “autoradiography” gibi çeşitli yöntemler kullanılır. Zaman zaman da bu bağlantının doğal olarak ifade edilmiş protein yoğunluğunu tespit etmek için antikorlar ile ikinci bir bağlantı kuracak enzimlerde kullanılmaktadır. “Western Blotting” sadece proteinlerin tespitleri için değil aynı zamanda onların niceliksel bilgilerini de araştırmacılara sağlarlar.

Analog olarak “Western Blotting” canlı hücre dokularındaki özellikli proteinlerin boyanması içinde kullanılır. Ama yaygın olarak bu işlem için hücre biyolojisinde FISH olarak adlandırılan “immunostaning” teknikleri kullanılmaktadır.

Eastern Blotting (Eastern Blot):

Bu teknik proteinlerin post-translasyonel değişikliklerini tespit etmek için kullanılır. Özel malzeme kullanılarak proteinlerdeki değişimleri gözlemlemek için proplanmış PVDF veya nitrocellulose yüzeylerine proteinler gömülür. Sonrasında diğer blotlama tekniklerinde olduğu gibi işaretlemeler yaptırılarak gözlemler elde edilmeye çalışılır.

DNA Arrays (DNA dizileme) Tekniği:

DNA dizileme tekniği; tek iplikli DNA oligonükleotid parçacıklarını içeren, mikroskop slâydı üzerinde katı bir yüzeye tutulmuş noktalar kümesinden oluşmaktadır. Bu sayede büyük parçalı DNA dizilerini bile 100 mikron gibi çok küçük noktalar üzerinde gözlemlenebilinir hale getiriliyor. Her noktada ise “Southern Blotting” tekniğinde de olduğu gibi incelenen DNA örneğinin tamamlayıcı zinciri bulunmaktadır. Bu teknik ile bir organizmanın gen ekspresyonu hakkında detaylı bilgi sahibi olunabilinmekte. Bu teknikte, doku içinde RNA izole edilerek işaretlenmiş kopya DNA’lara (c DNA) dönüştürülür. Bu cDNA daha sonra dizi üzerindeki parçalar ile görsel bir hibridizasyon gerçekleştirir. Çoklu dizileme tekniklerinin bulunması ile sağlıklı hücrelerin DNA dizilimleri ile kanserli hücrelerin DNA dizilimleri karşılaştırılabilinmektedir. Ayrıca herhangi bir organizmada ortam şartlarına göre gen ekspresyonun ne şekilde değişeceği de belirlenebilinir. Örneğin 7.000 gene sahip bir maya olan ''Saccharomyces cerevisiae'' gen ekspresyonlarının sıcaklığa bağlı olarak nasıl değişim gösterdiği de bu teknik ile tespit edilebilinir.

Mikro-dizilim teknikleri birden farklı yöntemle üretilebilinir. Genel olarak, 100 mikro çapında kuyucukların oluşturulduğu silikon çipler kullanılır. Bu çiplerin üzerinde 100 den 10.000 ne kadar kuyu olabilmektedir. Dizileme teknikleri sadece DNA’lar için değil aynı zamanda antikorlar içinde dizayn edilip protein ekspresyonları hakkında moleküler biyologların bilgiler elde etmesini sağlarlar.

Allele Specific Oligonucleotide (ASO):

ASO DNA’nın bir ipliğinde meydana gelen mutasyonların tespitinde kullanılır. Bu teknik PCR ve Jel elektroforez’e ihtiyaç duyulmadan kullanılmaktadır. 20-25 nükleotitli problar ile parçalanmamış DNA işaretlenir. Bu problarda işlem sürecinde hibridizasyonlar meydana gelir. Hatta baz değişikleri gizli hibridizasyonlar ile değişir. Sonra hedef DNA yıkanır ve hibrizide olmamış problar ortamdan bu sayede temizlenir. Problar ile hibridize olmuş hedef DNA bu probların yaydığı radyoaktif veya floresans ışımalar ile analiz edilir. Tüm moleküler biyoloji tekniklerinde olduğu gibi bu teknikte yapılan değişikliklerin başarılı sonuçlandığı göstermek için önemlidir. Bir baz çiftindeki dizilim farklılıklarını tanımlamak için “Illumina Methylation Assay” tekniği ASO’ya göre daha avantaj sağlamaktadır.

Eski Teknolojiler:

Moleküler Biyolojide teknolojiler geliştikçe eski teknolojiler artık tarih sayfalarında yerini almaktadır. Örneğin, jel elektroforez geliştirilmeden önce DNA parçacıklarının ayrılması “sükroz gradienti” üzerinde çok uzun süreler sonucu yapılıyordu. Ama buna rağmen yeni teknolojilerin çözüm bulamadığı bazı problemlerin çözümünde eski teknolojiler kullanılabilinmektedir.

Kaynak:  http://www.news-medical.net